2 結(jié)果與分析

2.1 維生素D₃聯(lián)合染料木素對MG-63細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞協(xié)同影響

采用MTT法測定藥物作用細(xì)胞24h后MG-63的細(xì)胞存活率。如圖1a所示，水平素D疏松維生素D₃在1.56～100.00μmol/L濃度對MG-63細(xì)胞無毒性，染料在6.25，木素12.50，維生25.00，骨質(zhì)50.00，作用100.00μmol/L濃度可明顯促進(jìn)MG-63細(xì)胞的細(xì)胞協(xié)同增殖（P＜0.05）。如圖1b所示，水平素D疏松染料木素在1.56～50.00μmol/L濃度對MG-63細(xì)胞無毒性。染料染料木素濃度在3.12，木素6.25和12.50μmol/L可顯著促進(jìn)MG-63細(xì)胞的維生增殖（P＜0.05）。故選擇1.56，骨質(zhì)3.12，作用6.25，細(xì)胞協(xié)同12.50，25.00，50.00μmol/L濃度進(jìn)行組合。如圖1c所示，低濃度的維生素D₃和染料木素聯(lián)合用藥對MG-63細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用，且濃度在6.25μmol/L時更為顯著。

ALP作為成骨細(xì)胞分化的前期標(biāo)志之一，可隨著成骨細(xì)胞的生長而表達(dá)增加，可以代表骨形成的狀態(tài)。藥物作用48h后測MG-63細(xì)胞的ALP活性。如圖2a和2b所示，藥物濃度在3.12～50.00μmol/L時，與染料木素和維生素D₃單藥組相比，聯(lián)合組可顯著增強MG-63細(xì)胞中ALP活性。維生素D₃在濃度為3.12μmol/L和6.25μmol/L時抑制了ALP活性，而聯(lián)合染料木素可使維生素D₃對ALP活性的抑制作用逆轉(zhuǎn)。染料木素濃度在3.12，6.25，12.50μmol/L時可顯著增強ALP活性。

交聯(lián)的蛋白質(zhì)和膠原蛋白隨著成骨細(xì)胞生長增殖，可產(chǎn)生羥基磷灰石并堆積在基質(zhì)中礦化，茜素紅可結(jié)合形成的鈣結(jié)節(jié)發(fā)生顏色變化，產(chǎn)生深紅色的化合物。選擇濃度為6.25μmol/L的維生素D₃，染料木素及其二者聯(lián)合用藥組進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)的檢測。礦化培養(yǎng)21d后，可在倒置顯微鏡下觀察到MG-63細(xì)胞中的鈣結(jié)節(jié)，礦化組和試驗組形成了更多的不透明結(jié)節(jié)。如圖2c所示，積累的鈣結(jié)節(jié)被茜素紅染成深紅色化合物，形狀不規(guī)則，表明有成骨活性。加入10％的西吡氯銨（CPC）溶解結(jié)合鈣結(jié)節(jié)的茜素紅以定量鈣沉積情況，在550nm下測量吸光度值，如圖2d所示，表明維生素D₃聯(lián)合染料木素可形成更多茜素紅和鈣產(chǎn)生的深紅色化合物促進(jìn)礦化基質(zhì)的形成。

2.2 染料木素和維生素D₃對MG-63細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響

藥物作用24h后，采用PT-PCR方法通過比較Ct法測定OPG和RANKL在成骨細(xì)胞的相對表達(dá)量。如圖3a和3b所示，與對照組相比，單藥染料木素組和維生素D₃組的OPGmRNA表達(dá)量均增加；而且與單藥組相比，染料木素聯(lián)合維生素D₃組OPGmRNA表達(dá)量顯著增加，但增加的作用不是呈劑量依賴性的。如圖3c和3d所示，與對照組相比，染料木素和維生素D₃組的MG-63細(xì)胞中RANKLmRNA表達(dá)均降低。在濃度為6.25～50.00μmol/L范圍內(nèi)，聯(lián)合組的RANKLmRNA表達(dá)比維生素D₃組顯著降低，而與染料木素組對比無差異。OPG與RANKL的相對比例破壞可能導(dǎo)致骨吸收增加，微結(jié)構(gòu)改變和骨折風(fēng)險，在破骨細(xì)胞生物學(xué)和骨吸收調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵決定因素和最終步驟的作用，如圖3e和3f所示，聯(lián)合組中OPG/RANKL的比值顯著大于維生素D₃和染料木素組，且染料木素、維生素D₃以及維生素D₃與染料木素聯(lián)合組對OPG/RANKL的比值均隨著藥物濃度的增大而減小。表明維生素D₃與染料木素聯(lián)合可能通過OPG/RANKL途徑對成骨細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生協(xié)同作用。此外，染料木素對MG-63細(xì)胞的增殖和分化作用較維生素D₃顯著。

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