隨著生活質量的超聲粗毛提高，人們日常生活中對高脂、微波高糖、協同纖孔高能量飲食的制備作用攝入增加，導致高血脂癥患病人群數量增加，菌多降脂究高血脂癥已成為世界關注的糖及體外重點問題。預防與治療高脂血癥的超聲粗毛方法有運動鍛煉、控制飲食和藥物治療等方式，微波其中藥物治療方式效果雖好，協同纖孔但是制備作用有毒副作用。有研究表明天然產物中含有許多降血脂的菌多降脂究物質，從天然產物中開發降血脂的糖及體外物質成為當今研究熱點。

粗毛纖孔菌Inonotushispidus（Bull.）Pat.，超聲粗毛又名粗毛黃褐孔菌，微波是協同纖孔一種非常珍貴的藥用真菌。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物活性。目前已經從粗毛纖孔菌中分離得到多種具有生物活性的化合物，包括多糖類、三萜類和酚類等。多糖作為粗毛纖孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用。但提取方法對有效活性成分的提取效果以及活性的影響很大。張倩等研究熱水浸提和超聲微波協同提取對枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影響，結果表明超聲微波協同法得到的枸杞多糖提取率顯著高于熱水浸提法，且超聲微波協同法得到的多糖對自由基的清除能力比熱水浸提法更好。蘇平等研究四種不同輔助提取方法對黃秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影響，四種方法對比發現酶法提取的黃秋葵花多糖提取率最高，四種方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超聲輔助提取的多糖表現出更強的抗氧化活性。馬舒偉等研究不同方法對玄參多糖單糖組分和抗氧化活性的影響，不同方法提取的玄參多糖對比發現，酶輔助提取法提取的玄參多糖的純度最高，體外抗氧化活性最強。

超聲微波協同輔助提取法充分利用了超聲波震動的空化作用與微波的高能效應和熱效應，將超聲微波相結合，既能縮短提取時間，又可以提高提取效率，從而實現高效快速的處理樣品，有學者采用微波超聲組合提取猴頭菇多糖與熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法相比，發現微波超聲聯用組合具有節省時間和多糖浸出率高等優點。因此為提高粗毛纖孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken試驗設計研究了超聲微波協同制備粗毛纖孔菌多糖的工藝，并與微波輔助提取法和熱水提取法對比分析了粗毛纖孔菌多糖提取率及體外膽酸鹽結合能力，以期為把粗毛纖孔菌多糖開發成為一種降脂功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌子實體于2020年9月采自東北林業大學林場；葡萄糖、濃硫酸、苯酚國產分析純；甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）上海源葉生物生物科技有限公司。Scientz-IIDM型微波光波超聲波萃取儀寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；722s型紫外分光光度計上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器公司；SHB-Ⅲ型循環水真空泵鄭州長城科工貿有限公司；GL10048型萬分之分析天平上海佑科儀器儀表有限公司；TDL40BW型臺式離心機上海星科科學儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水槽上海力辰儀器科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理

將采摘的新鮮粗毛纖孔菌子實體于烘箱中60℃烘干，高速粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 超聲微波協同制備粗毛纖孔菌子實體多糖工藝

1.2.2.1 單因素實驗

準確稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，加入一定體積的蒸餾水，充分攪拌后放置微波光波超聲波萃取儀中，固定實驗參數料液比1:30g:mL，超聲時間30min，超聲功率200W，微波時間30s，微波功率300W，分別考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g:mL），超聲時間（10、20、30、40、50、60min）、超聲功率（100、200、300、400、500W）、微波時間（10、20、30、40、50、60s）、微波功率（100、200、300、400、500、600W）對超聲微波輔助提取粗毛纖孔菌多糖提取率的影響，將制備得到的多糖提取液在4000r/min離心15min，上清液即為粗毛纖孔菌子實體多糖溶液，殘渣按上述步驟復提兩次，合并提取液。在旋轉蒸發儀上60℃旋轉蒸發至原體積的1/4，冷卻后測多糖含量。得出五個單因素對IHP提取率的影響，最終根據單因素實驗結果確定響應面試驗的因素和水平。

1.2.2.2 響應面設計

根據單因素的實驗結果，使用Design-Expert8.0軟件進行響應面試驗設計，因素水平表見表1。根據響應面試驗結果，建立數學模型，確定IHP的最佳提取條件。

1.2.3 不同提取方法對粗毛纖孔菌多糖提取率的影響

將優化后的超聲微波輔助法對IHP的提取率與熱水浸提法和超聲輔助法進行對比。超聲微波輔助提取法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，置于放置微波光波超聲波萃取儀中，設定超聲時間51min，超聲功率200W，微波時間50s，微波功率500W進行提取，離心取上清液，測多糖含量。熱水浸提法和超聲輔助法采用預實驗優化得到的工藝條件。熱水浸提法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，60℃水浴浸提3h，提取結束后，離心取上清液，測多糖含量。超聲輔助法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分攪拌后，置于放置微波光波超聲波萃取儀中，設置超聲功率200W，超聲時間1h，提取結束后，離心取上清液，測多糖含量。

1.2.4 粗毛纖孔菌多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的制作

采用苯酚-硫酸法測定糖含量[21]準確稱取經真空干燥恒重的葡萄糖40mg，于500mL容量瓶中定容配制成80μg/mL的葡萄糖標準液，取2.0mL蒸餾水為空白樣，用移液槍依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL葡萄糖標準液于具塞試管，各管補加蒸餾水至2.0mL，加入6%苯酚1mL，98%濃硫酸5mL，靜置10min后振蕩混勻，室溫下靜置20min后，充分反應，于490nm下測定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標作葡萄糖標準曲線。得到的線性回歸方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于計算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的測定

準確吸取2mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0mL和98%濃硫酸5.0mL，靜置10min后振蕩混勻，在室溫下放置20min，于490nm下測定OD值。若測得樣品多糖濃度不在測量范圍內，應當稀釋再次測量。粗毛纖孔菌多糖的提取率為提取液中的多糖與總多糖的比值，在預實驗中，采用熱水法反復多次提取確定了粗毛纖孔菌子實體多糖含量為16.4%。提取率計算公式為：

式中：C為根據標準曲線計算得到的粗毛纖孔菌水提液液所含多糖的質量濃度，μg/mL；V為粗毛纖孔菌水提液總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數；k為粗毛纖孔菌子實體粉末的重量，g；m為1g粗毛纖孔菌子實體粉末總多糖含量，%。

1.2.5 體外降脂實驗

1.2.5.1 膽酸鹽標準曲線的繪制

膽酸鹽測定方法參照文獻分別取不同濃度的膽酸鹽標準溶液（甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3mmol/L，牛磺膽酸鈉0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mmol/L），2mL于具塞試管中，向每管標準溶液中依次加入6mL質量分數60%的H₂SO₄，70℃恒溫水浴鍋中水浴20min，取出后進行冰浴5min，在387nm處測定吸光度，分別作兩種膽酸鹽標準曲線，計算回歸方程，牛黃膽酸鈉的回歸方程為y=2.8591x-0.0176，R²=0.9957，可以用于計算牛磺膽酸鈉含量。甘氨膽酸鈉的回歸方程為y=1.5012x+0.0536，R²=0.9957，可以用于計算甘氨膽酸鈉含量。

1.2.5.2 粗毛纖孔菌多糖膽酸鹽結合能力的測定

粗毛纖孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4℃醇沉24h，離心，去除上清液，沉淀即為粗毛纖孔菌粗多糖，將粗多糖用蒸餾水配制成20mg/mL多糖溶液分別吸取1mL粗毛纖孔菌粗多糖溶液于100mL具塞三角瓶中，加入1mL10mg/mL胃蛋白酶，3mL0.01mol/L的HCl溶液，在37℃恒溫振蕩，模擬胃環境（pH為1.5）消化1h；以0.1mol/L的NaOH溶液調節溶液pH至6.3，再加入4mL10mg/mL胰蛋白酶，模擬腸道環境進行消化1h，加入4mL1mmol/L膽酸鹽消化1h，4000r/min離心20min，取上清液，比色測定膽酸鹽含量，平行3次實驗。甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結合率按下式計算。

式中：c₁為甘氨膽酸鈉加入量，μmol，c₂為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol，c₃為牛磺膽酸鈉加入量，μmol，c₄為牛磺膽酸鈉剩余量，μmol。

1.3 數據處理

實驗重復三次，試驗中的數據運用SPSS17.0軟件進行方差分析（analysisofvariance，ANOVA）單因素方差分析，數據以表示，組間做t檢驗，P＜0.05則表示有顯著性差異，有統計學意義。

相關鏈接：硫酸，牛磺膽酸鈉，胃蛋白酶，胰蛋白酶

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